【ELISA攻略】ELISA關鍵一步!這10類樣品要如何處理?

       Elisa是一種快速、靈敏、準確可靠的定性定量分析方法。樣本的處理對于Elisa 實驗的成功起著關鍵的作用。處理樣本的過程就是收集目標蛋白的過程，由于蛋白容易變性，降解，故該過程應盡量溫和。樣本處理之后的儲存也非常重要，尤其注意不要反復凍融。

樣本處理之后可分裝密封保存，最佳保存條件:2-8C保存應小于5天，-20°不應超過6個月，-80℃不應超過2年，超過以上時間應保存在液氮中。凍存的標本融化時，為了減少冰晶(0度)對樣品的破壞，應采用15-25°C水浴快速融化，融化后可用于檢測或暫存于2-8°℃。正確處理樣本的方法是保證ELISA檢測準確性的第一步。

利用ELISA進行檢測的樣本類型包括:血液(血清、血漿)、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清、尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、胸腹水、前列腺液、精液、陰道分泌物等。

常見的樣本處理 方法如下，僅供參:

血液樣本

1.血清:

①將收集于血清分離管的全血樣本，在室溫放置2小時或2-8°C過夜。(這是一個讓血液自然凝固的過程，溫度越低，

凝集越緩慢，可根據(jù)需要添加促凝劑。)

②1000xg離心 20 分鐘，取上清。

③可立即檢測，或分裝凍存于-20°C或-80'℃。

2.血漿(檸檬酸，EDTA,肝素):

①血漿樣本需要抗凝，將全血收集到干凈的含抗凝劑的試管中，輕輕混勻。

②標本在采集后的30分鐘內于2-8°℃ 1000xg離心15分鐘，取上清。

③可立即檢測，或分裝凍存于-20°C或-80°℃。

血清/血漿的區(qū)別與選擇

血清是血液凝固后缺少纖維蛋白原的血漿，故血漿中除含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均等同于血清。由于血清中缺乏很多的凝血因子，但有凝血產(chǎn)物。如果檢測凝血因子，建議選擇血漿樣本;

因血漿中有纖維蛋白原，如果纖維蛋白原對待檢測指標有影響，建議選擇血清樣本;大多數(shù)情況下二者均可以選擇。

組織樣本

組織樣本一般制成組織勻漿，處理方法如下:

①使用干凈的工具解剖目標組織，盡快置于冰上，以防被蛋白酶降解。(暫時不處理的組織，置于圓底微量離心管中，浸入液氮中“速凍”，在 -80'℃下存儲樣品備用)

②用預冷的PBS緩沖液(0.01M，pH=7.4)洗滌組織去除殘留的血液，稱重后備用。若組織塊較大，需先剪碎。

③在冰上用研磨緩沖液(常用PBS緩沖液，但最好使用50mM Tris+0.9%NaCL+0.1% SDS,PH 7.3。或者中等強度RIPA 細胞裂解液，注意 RIPA 裂解液 PH 值需為PH7.3，建議不要使用含NP-40，TritonX-100和高濃度DTT的組分，會抑制抗原抗體反應。)

研磨組織勻漿(加入研磨緩沖液的體積取決于組織的重量。一般情況下，每1克組織碎片應使用9ml研磨緩沖液。另外建議在研磨緩沖液中加入一些蛋白酶抑制劑，如1mMPMSF)。得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融進一步處理(超聲破碎過程中，需冰浴降溫;反復凍融法可重復2次)。

④將制備好的勻漿液于 5000xg離心5分鐘，留取上清即可檢測。或分裝凍存于-20°C或-80'℃。

⑤根據(jù)實驗需要，組織勻漿樣本可先定量總蛋白,以便于統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，一般調整總蛋白濃度至 1-3mg/ml。某些組織樣本，如肝臟，腎臟，胰腺因含有較高濃度的內源性過氧物酶在樣品濃度較高的情況下會和試劑盒底物反應出現(xiàn)假陽性。

注意事項:

若為皮膚組織，離心后，需去除上層脂肪，以及下層沉淀取中間層樣本用于檢測。

細胞樣本

1.細胞培養(yǎng)上清:

①使用 96，24，6孔板，(貼壁或懸浮)細胞密度達到60-90%。

②使用6-10mm培養(yǎng)皿，T25/T75細胞培養(yǎng)瓶，(貼壁或懸浮)細胞密度達到60-90%。

③懸浮細胞:2-8'℃，2500rpm離心5min，收集澄清的細胞培養(yǎng)上清。

④貼壁細胞:直接收集上清液，2-8°℃，2500rpm離心5min，收集澄清的細胞培養(yǎng)上清。

⑤立即用于檢測，或分裝于-80'C凍存?zhèn)溆谩?/span>

2.細胞裂解液:

(1)懸浮細胞:

①2-8°℃，2500rpm離心5min，收集細胞。2加入預冷的PBS,輕輕混勻，2-8°℃，2500rpm離心5min，收集細胞。

③加入0.5-1ml中等強度RIPA細胞裂解液(注意RIPA裂解液PH值需為PH7.3，建議不要使用含NP-40，Triton X-100 和高濃度 DTT 的組分，會抑制抗原抗體反應。若無 RIPA 裂解液，可使用50mM Tris+0.9%NaCL+0.1%SDS,PH 7.3)及適量蛋白酶抑制劑(如 PMSF，工作濃度1mmol/L),置于冰上，裂解 30min-lh。裂解過程中可用槍頭吹打或間斷搖動離心管，使蛋白充分裂解,出現(xiàn)黏糊狀是 DNA，可以使用超聲波破碎DNA。(或用超聲波3-5mm探頭，功率150-300W,冰上超聲處理樣品，工作1-2s，停止30秒，3~5個循環(huán)。)

④裂解或超聲破碎完成，2-8°℃，10000rpm 離心 10min上清移入 EP 管中，立即用于檢測，或分裝于-80°C凍存?zhèn)溆谩?/span>

(2)懸浮細胞:

①吸走上清液，加入預冷的 PBS 洗三次。

②加入0.5-1m[ RIPA 細胞裂解液及適量蛋白酶抑制劑(具體要求同懸浮細胞)，用細胞刮輕輕刮下貼壁細胞。

③細胞懸液轉入離心管中，置于冰上，裂解 30min-1h，或者配合超聲波破碎(同懸浮細胞)。

④裂解或超聲破碎完成，2-8°℃，10000rpm 離心 10min上清移入 EP 管中，立即用于檢測，或分裝于-80°C凍存?zhèn)溆谩?/span>

注意事項:

細胞裂解液，建議使用超聲波輔助破碎，超聲波可有效打斷DNA，DNA 成為片段后不容易干擾試劑盒工作。

細胞培養(yǎng)上清液/細胞裂解液的選擇:

根據(jù)目的物所在部位，可選擇細胞裂解液或細胞培養(yǎng)上清作為樣本。

如果目的物是分泌型，(包括可分泌型的膜蛋白)，即可選擇細胞培養(yǎng)上清作為樣本;

如果目的物主要存在于胞內，則建議選擇細胞裂解液作為樣本類型，部分包內蛋白也可能通過分泌或者細胞凋亡而泄露到培養(yǎng)基中而上清也可被檢測。

痰液樣本

①選擇痰液中較為粘稠部分稱重，加兩倍于痰量的0.1%DTT(二硫蘇糖醇,主要作用是溶解粘液)，反復吹打，漩渦器振蕩 15s，37 度恒溫水浴振蕩5分鐘;

②加兩倍于痰量的PBS緩沖液,繼續(xù)振蕩15-20分鐘，150目的金屬絲網(wǎng)過濾，1500rpm離心10分鐘吸取上清液檢測。

唾液、尿液樣本

用無菌管收集樣品，2-8°C下以10,000xg離心2分鐘。或2000-3000rpm離心20分鐘，收集上清液，可立即檢測，或分裝凍存于-20°C或-80°℃。盡量減少凍融循環(huán)。